Возможны противопоказания. Необходимо ознакомиться с инструкцией или проконсультироваться со специалистомРусский   ENGLISH

Эффективность на культурах грибов

ИЗ МАТЕРИАЛОВ ТРЕТЬЕГО ВСЕРОССИЙСКОГО КОНГРЕССА ПО МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ
(Москва, 24 25 марта 2005 г.)

АРЗУМАНЯН В. Г.1, КИРИЧЕНКО И. М. 2

1. НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН. 2. ММА им. И. М. Сеченова

Оценка эффективности Мирамистина® in vitro на культурах клинически значимых дрожжевых грибов

За последние десятилетия вследствие активной антибиотикотерапии постоянно растет удельный вес заболеваний, ассоциированных с грибковой микрофлорой. Среди прочих грибов значительная часть клинических изолятов представлена дрожжами - аско и базидиомицетами, которые в вегетативной стадии размножаются почкованием или делением, что приводит к одноклеточному росту [Kurtsman C. P., Fell J. W., 1998]. На се годняшний день наиболее клинически значимыми считают та кие грибы, как Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum и Malassezia, а также их телеоморфы. Важнейшим направлением клинической микологии является разработка, оценка и внедрение эффективных противогрибковых препаратов. В ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН с 1999 года проводятся исследования по сравнительному анализу действия различных антимикотиков на культуры клинических изолятов дрожжевых грибов. В этот список препаратов вошел и Мирамистин®. Целью настоящей работы явилась оценка действия Мирамистина® на культуры различных родов клинически значимых дрожжей в сравнении с прочими антимикотиками.

В работе использованы культуры аско и базидиомицетных дрожжей, ранее выделенные нами от пациентов с атопическим дерматитом и аллергическими бронхолегочными заболевания ми, хранящиеся в коллекции НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН [Арзуманян В. Г., Семенов Б. Ф., 2001]. Изоляты нелипофильных дрожжей идентифицированы классическим физиологобиохимическим методом [Yarrow D., 1998] с использованием компьютерной программы Барнетта [Barnett J., 1996]. Дрожжи рода Malassezia получены и идентифицированы согласно методике Гийо и Гэо [Guillot J., Gueho E., 1996]. Для исследования отобраны 7 изолятов Candida albicans, 7 изолятов дрожжей Malassezia, 6 из которых являются

M. sympodialis, 1 - M. furfur. Дрожжи рода Rhodotorula представ лены видами R. glutinis (8 культур), R. aurantiaca (7), R. mucilagi nosa (3) и R. minuta (1). Все 5 изолятов Cryptococcus spp. идентифицированы как C. albicans, а дрожжи рода Trichosporon включали 5 изолятов: T. inkin - 1, T. cutaneum - 1, T. ovoides - 1,  T. asahii - 2.

В качестве исследуемого материала использовали 2суточ ные культуры, выращенные на плотной среде ГПД при 25°С (нелипофильные дрожжи) или среде Диксона при 32 °С (Malassezia spp.). Исходная концентрация жизнеспособных клеток составляла 1х103-1х104 КОЕ/мл. Диапазон исследованных концентраций Мирамистина® составлял от 2 до 256 мкг/мл, в случае Malassezia - до 512 мкг/мл. Изучение минимальных подавляющих рост концентраций (МПК) проводили в стерильных круглодонных пластиковых планшетах на 96 лунок при 25°С. Вначале в один ряд по вертикали вносили аликвоты препаратов, затем в остальные ячейки - стерильную дистиллированную воду и делали двукратные разведения препаратов с помощью многоканального дозатора. После этого ячейки заполняли заранее приготовленной суспензией клеток в жидкой синтетической среде, оптимальной для роста всех известных нелипофильных дрожжей [Yarrow D., 1998]. О росте культур судили по изменению цвета введенного в эту среду рНиндикатора (неизменный цвет означал торможение роста).

Проверку чувствительности культур Malassezia spp. проводили модифицированным методом разведений в агаре [Hammer K. A. et al., 2000]. Модификация заключалась в использовании 96лу ночных плоскодонных планшетов, в которые вносили аликвоты концентрированных препаратов и делали их серийные двукратные разведения. Затем в ячейки вносили инокулированный теплый агар Диксона, и инкубировали 5-6 суток при 32°С до появления микроколоний в контрольном агаре (не содержащем антимикотиков). За МПК препарата принимали его минимальную концентрацию, при которой образования микроколоний не отмечалось.

Наиболее чувствительными к Мирамистину® оказались дрожжи C. albicans, МПК для которых составили менее 16 мкг/мл. Проверка 7 изолятов C. albicans с мирамистином показала, что начало ингибирования роста (небольшое изменение цвета индикатора) на 4 сутки соответствовало концентрации 16-64 мкг/мл, а минимальная концентрация, при которой рост совсем отсутствовал, была равна 128 мкг/мл. Все изоляты Trichosporon spp. не росли уже при 64 мкг/мл, а рост большинства культур Rhodotorula spp. был подавлен 32 мкг/мл. Из этого списка родов резко выделялись Malassezia, для которых характерны значения МПК 512 мкг/мл и выше. Проверка Мирамистина® в отношении самой быстро растущей культуры Malassezia furfur N 607 показала, что наличие в среде даже 6000 мкг/мл препарата не могло полностью подавить рост микроорганизмов. Однако, число ми кроколоний в агаре в опытном варианте по сравнению с конт ролем без Мирамистина® было значительно ниже. Ранее нами показано, что необычная по сравнению с прочими дрожжами устойчивость дрожжей Malassezia к экстремальным осмотическим условиям (насыщенный раствор NaCl) обусловлена наличием у них внешней липидной оболочки [Гейдебрехт О. В. с со авт., 2003], которой лишены другие дрожжи. Есть основание полагать, что резистентность к поверхностноактивному Мирамистину® также связана с липидным слоем, покрывающим клетки Malassezia. Концентрация Мирамистина® в коммерческих препаратах составляет, как правило, 0,01% (100 мкг/мл). Таким образом, вероятнее всего, использование Мирамистина® для уст ранения дрожжей родов Candida, Rhodotorula, Cryptococcus и Trichosporon не должно сопровождаться элиминацией Malassezia, например, с поверхности кожи. Это очень важно, поскольку дрожжи рода Malassezia являются представителями нормальной микрофлоры кожи человека.

Пределы МПК ряда препаратов - азолов (орунгал, дифлю кан, низорал, клотримазол), а также нитрофунгина, леворина, пимафуцина, нитроксолина, экзодерила (тербинафина), исследованные у вышеуказанных культур, обсуждались нами ранее [Арзуманян В. Г., 2002]. Укажем здесь лишь очевидные разли чия по сравнению с Мирамистином®. При всей резистентности к Мирамистину®, дрожжи рода Malassezia очень чувствительны к антимикотикам азольной группы: величины МПК азолов для Malassezia ниже 2 мкг/мл, в то время как именно к азолам из ученные штаммы базидиомицетов - Cryptococcus, Rhodotorula и Trichosporon - в упомянутом диапазоне концентраций нечувствительны.

Поскольку для нелипофильных дрожжей была использована жидкая среда, оказалось возможным провести сравнительную оценку фунгицидного эффекта различных препаратов по отношению к изучаемым штаммам. По истечении 10 суток из ячеек, соответствующих МПК, делали высевы на плотную среду для проверки жизнеспособности. Результат выражали как процент культур данного рода, оказавшихся нежизнеспособными. В отношении всех четырех родов нелипофильных дрожжей наиболее выраженным фунгицидным эффектом обладал Мирамистин® - 57% убитых культур Candida spp. и 100% культур базидиомицетов. Среди прочих препаратов в порядке убывания фунгицидной активности можно перечислить пимафуцин, леворин, 5НОК и нитрофунгин. Азолы не являлись фунгицидами не только в отношении базидиомицетов (0% убитых культур), но и большинства штаммов Candida spp.(0-14 %).

Таким образом, Мирамистин® является эффективным фунгицидным препаратом, более активным в отношении нелипофильных оппортунистических дрожжевых грибов, нежели липофильных симбионтов человека Malassezia spp. МПК мирамистина для нелипофильных дрожжей (16-128 мкг/мл) сравнима с концентрациями препарата, используемыми в клинике (100-400 мкг/мл).