Возможны противопоказания. Необходимо ознакомиться с инструкцией или проконсультироваться со специалистомРусский   ENGLISH

Вирус простого герпеса 1 и 2 типов

БАРИНСКИЙ И. Ф.1, АЛИМБАРОВА Л. М.1, КИРИЧЕНКО Н. А.2, СВИСТОВ В. В.3, СМИРНОВ И. В.3, КРИВОШЕИН Ю. С.3

НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН; 2. ММА им. И. М.Сеченова; 3. Компания «Инфамед», Москва

ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ МИРАМИСТИНА® В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ТИПОВ 1 И 2

Среди вирусных заболеваний герпетическая инфекция, обусловленная вирусами простого герпеса (ВПГ) 1го и 2го типов, занимает одно из ведущих мест. У большинства здоровых людей ВПГ1 и ВПГ2 вызывают широкий спектр заболеваний, при чем как острую первичную инфекцию, так и рецидивирующие заболевания кожи и слизистых оболочек. У новорожденных и лиц с иммунодефицитами инфекция может протекать особенно тяжело и заканчиваться летальным исходом. Для профилактики и терапии ВПГинфекции предложено много средств, однако препаратами выбора остаются нуклеозидные аналоги (например, ацикловир), которые обладают селективной антигерпесвирусной активностью, обусловленной подавлением репликации вируса и инактивации вирусной ДНКполимеразы. С 1982 года стали регистрироваться штаммы ВПГ, устойчивые к действию ацикловира (АЦВ), а за последние 10 лет, когда АЦВ стал основным противогерпетическим средством, частота выделения таких штаммов резко возросла, особенно от иммунокомпроме тированных лиц [5]. По данным разных авторов, АЦВрезистентные штаммы ВПГ встречаются в 4-14% случаев у онкологических больных, ВИЧинфицированных и лиц, перенесших трансплантацию органов и тканей или получающих длительную иммуносупрессивную терапию. В этой связи актуальной задачей является поиск и изучение новых противогерпетических средств с альтернативным механизмом противовирусного действия.

Антисептик Мирамистин® из группы катионных детергентов широко используется для индивидуальной профилактики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), в том числе герпесвирусной инфекции (ГИ), а также для лечения бактериальногрибковых осложнений у больных ЗППП. Имеются данные об успешном применении Мирамистина® при лечении воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей и легких различной этиологии. Сообщалось, что Мирамистин® проявляет антимикробную активность по отношению к бактериям, грибам, простейшим, а также обладает иммуномодулирующим, иммуноадъювантным и регенерирующим действиями, способностью повышать неспецифическую резистентность организ ма. Имеются данные о противовирусном действии Мирамистина® в отношении ретровирусов (ВИЧ), парамиксовирусов (кори, паротита) и некоторых других вирусов [1, 2]. Обнаружено, что Мирамистин® проявляет активность на ранних этапах инфекционного процесса; в основе его действия лежит предотвращение адсорбции и пенетрации вируса в клетки хозяина. Учитывая, что механизм противовирусного действия Мирамистина® отличается от действия АЦВ, можно предположить, что использование Мирамистина® для профилактики и комплексной терапии ГИ позволило бы снизить не только частоту появления штаммов ВПГ, резистентных к действию ацикловира и его аналогов, но и снизить распространенность вируса среди лиц групп риска, а также повысить эффективность противогерпетического лечения.

Целью исследования было изучение in vitro противовирусной активности мирамистина на модели экспериментальной герпес вирусной инфекции, обусловленной ВПГ 1го и 2го антигенного типов, в культуре клеток VeroB.

Материалы и методы

Вирусы. Использовали ВПГ 2го антигенного типа, штамм "ВН", и ВПГ 1го типа, штамм "ЕС", полученные из лаборатории музейных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Указанные вирусы после трех пассажей и титрования на культуре клеток VeroB хранили при минус 70 °С. Титр вируса определяли по Риду и Менчу и выражали в ТЦД50/мл. Титр ВПГ2 составил 5,0 ТЦД50/мл, ВПГ1 - 5,25 ТЦД50/мл. Для заражения использовали вирус в дозе 10-100 ТЦД50/лунку.

Культура клеток. Испытание противовирусной активности препарата мирамистин проводили на монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленых мартышек VeroB, получен ной из коллекции культур тканей НИИ вирусологии РАМН. Клетки культивировали в ростовой среде Игла (производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco), 2 мМ Lглутамина (Sigma, США) и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Поддерживающая среда отличалась тем, что в нее вносили 2% ЭТС. Клетки выращивали в 96луночных планшетах (Costar, GB) при 37 °С во влажной атмосфере, со держащей 5% СO2; посевная доза - 500 тыс. клеток/мл или 50 тыс. клеток/лунку (в объеме 100 мкл).

Препараты. Препарат Мирамистин® предоставлен компанией "ИНФАМЕД" (Москва) в виде стерильного 1%го раствора (рН 6,8). В опытах использовали стерильные растворы препарата в диапазоне концентрации от 0,1 до 0,0005% (5-1000 мкг/мл). Препарат до нужной концентрации разводили питательной средой Игла, не содержащей сыворотки.

В качестве препарата сравнения использовали коммерческий препарат зовиракс (Zovirax, GlaxoWellcome, Smith Kline Beechem, Великобритания). Его разводили согласно инструкции в стерильной дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл и хранили при минус 20 °С. Перед проведением эксперимента маточный раствор выдерживали при комнатной температуре и асептически готовили рабочие концентрации (от 1000 мкг/мл до 0,02 мкг/мл).

Дизайн исследования. После полного формирования в лунках планшета монослоя клеток VeroB (в течение 24 ч) ростовую среду удаляли, клетки троекратно отмывали средой Игла и вносили в лунки в составе поддерживающей среды Мирамистин® (в максимально переносимых и меньших концентрациях) по одной из нижеприведенных схем. Противовирусную активность препаратов (ПАП) оценивали общепринятыми методами по их способности предотвращать развитие индуцируемого вирусами цитопатического действия (ЦПД) и ингибировать репродукцию вирусов в культуре клеток, а также по наличию вирулицидного действия [7, 8]. Для профилактики герпесвирусной инфекции широко применяются вирулицидные препараты, оказывающие непосредственное разрушающее действие на вирусные частицы (например, оксолиновая мазь). Оценку вирулицидного действия проводили для того, чтобы выяснить, посредством какого механизма Мирамистин® проявляет свою активность в отношении вируса простого герпеса: подавления репродукции вируса или в результате разрушения (повреждения) им вирусных частиц.

Схема 1 (оценка цитотоксического действия препарата на неинфицированные клетки): различные концентрации препарата вводили в состав поддерживающей среды, которой покрывали сформировавшийся монослой. Планшеты инкубировали в течение 96 ч как указано выше. Действие препарата оценивали ежедневно методом световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя.

Определяли ЦТД50 препарата, которая соответствовала концентрации, вызывающей видимые нарушения морфологии у 50% клеток монослоя и максимально переносимую концентрацию (МПК) - наиболее высокую дозу препарата, не вызывающую видимых изменений клеточного монослоя, по сравнению с контролем. Для дальнейшего исследования применяли концентрации препаратов, не превышающие МПК.

Схема 2 (определение прямого вирулицидного действия препарата на вирионы ВПГ): в течение 1 ч инкубировали суспензии штаммов ВПГ2 или ВПГ1 в присутствии различных концентраций препарата в среде Игла при 37 °С в атмосфере с 5% СO2 с последующим титрованием суспензии в культуре клеток. Инокулюмы из серийных разведений (101-106), вносили в лунки планшета с монослоем, планшеты инкубировали 1 ч при 37 °С в атмосфере с 5% СO2, затем суспензию вируса удаляли, клетки троекратно отмывали средой Игла и вносили в лунки свежую питательную среду, после чего планшеты инкубировали 96 ч в тех же условиях.

Схема 3. (оценка ранней профилактической активности): внесение препарата за 1 ч до инфицирования клеток. В лунки планшета с отмытым монослоем вносили питательную среду, содержащую мирамистин в указанных концентрациях и инкубировали, как описано выше. Через 1 ч в лунки планшета вносили суспензию вируса и инкубировали в течение 1 ч. Затем суспензию вируса удаляли, в лунки вносили питательную среду, не содержащую препарат, и планшеты инкубировали, как описано выше, в течение 96 ч.

Схема 4. (оценка экстреннопрофилактической активности): внесение препарата за 1 ч до/ и через 1 ч после инфицирования клеток. В лунки планшета с отмытым монослоем вноси ли питательную среду, содержащую мирамистин в указанных концентрациях, затем клетки инкубировали в указанных выше условиях. Через 1 ч в лунки планшета вносили суспензию вируса и инкубировали еще 1 ч. Затем среду с не связавшимися вирусами удаляли и вносили в лунки питательную среду, содержащую препарат в тех же концентрациях. Через 15 мин действие препарата останавливали внесением в каждую лунку по 100 мкл ЭТС, планшеты помещали в термостат и выдерживали в тех же условиях в течение 96 ч.

Схема 5. (оценка поздней профилактической активности): внесение препарата через 1 ч после инфицирования клеток. В лунки планшета с отмытым монослоем вносили суспензию вируса и инкубировали в течение 1 ч. Затем суспензию вируса удаляли и вносили в лунки питательную среду, содержащую препарат в указанных концентрациях. Через 15 мин действие препарата останавливали внесением в каждую лунку по 100 мкл ЭТС, планшеты помещали в термостат и выдерживали в течение 96 ч в указанных выше условиях.

Оценку вирусиндуцированного ЦПД и противовирусной активности препаратов в культуре клеток проводили ежедневно при световой микроскопии по степени изменения морфологии клеточного монослоя. [7]. Учет результатов проводили при наличии 100% ЦПД в лунках с контролем вируса - через 72-96 ч от момента инфицирования (в случае ВПГ1 или ВПГ2, соответственно).

С целью изучения влияния различных концентраций мирамистина на репродукцию вируса на 3-4е сутки после инфицирования отбирали соответствующие пробы вируса и определяли его остаточную инфекционность. Пробы отбирали в микропробирки с крышкой (Eppendorf) и сохраняли при минус 70 °С. Перед постановкой опыта пробы подвергали троекратному за мораживаниюоттаиванию. Затем клеточный дебрис удаляли центрифугированием, готовили серийные 10кратные разведения проб, которыми в дальнейшем инфицировали отмытый монослой клеток VeroB. Планшеты инкубировали 1 ч, затем суспензию вируса удаляли, трехкратно отмывали клетки от не связавшегося вируса и вносили в лунки свежую питательную среду. Планшеты выдерживали в течение 96 ч в указанных ранее условиях. Результаты титрования оценивали по общепринятой методике.

Противовирусную активность препарата оценивали по 50%й ингибиторной концентрации (ИК50), т. е. минимальной концентрации препарата, при которой ЦПД вируса уменьшалось наполовину по сравнению с контролем.

Статистическую обработку результатов исследования проводили методом вариационной статистики с использованием прикладных программ Excel5.0. Достоверность разности полученных результатов оценивали с помощью критерия t Стьюдента, различия признавали достоверными при p < 0,05 [3, 4].

Результаты и обсуждение

Вначале в серии экспериментов изучено цитотоксическое действие Мирамистина® (по схеме 1 в диапазоне концентраций 5-1000 мкг/мл) на перевиваемую линию клеток VeroB. Установлено, что степень выраженности цитотоксического эффекта зависит от использованной концентрации Мирамистина®. Так, в концентрации 1000 мкг/мл препарат вызывает практически полную гибель клеток через 24 ч после контакта с ними, а в концентрации 500 мкг/мл вызывает изменение у 50% клеток монослоя (ЦТД50). МПК Мирамистина® для клеток VeroB составила 100 мкг/мл. По данным теста с трипановым синим, процент жизнеспособных клеток через 96 ч инкубировання в присутствии 5-100 мкг/мл Мирамистина® практически не отличался от такового в контроле. Показатель ЦТД50 зовиракса составил 750 мкг/мл, МПК - 500 мкг/мл.

Изучение активности Мирамистина® по схеме 2 в концентрациях 5-5000 мкг/мл показало, что препарат проявляет прямое дозозависимое вирулицидное действие в отношении ВПГ2 и ВПГ1 (табл. 1).

Таблица 1

Определение прямого вирулицидного действия Мирамистина® на вирионы ВПГ1 и ВПГ2

Доза мирамистина, мкг/мл

Вирус простого герпеса 2го типа, шт. ВН

Вирус простого герпеса 1го типа, шт. ЕС

Титр вируса, lg ТЦД50/мл

Снижение титра относительно контроля, lg ТЦД50/мл

Титр вируса, lg ТЦД50/мл

Снижение титра относительно контроля, lg ТЦД50/мл

100-500

0*

5,00

0

5,25

50

0

5,00

1,00

4,25

25

4,00

1,00

3,00

2,25

12

4,25

0,75**

3,00

2,25

6

5,00

0

5,25

0

0 (контроль)

5,00

-

5,25

-

 Примечание: * менее 0,25 lg ТЦД50/мл; ** различия с контролем статистически недостоверны (p>0,05)

Как видно из данных, представленных в таблице 1, вирулицидное действие Мирамистина® в отношении вирионов ВПГ2 было немного активнее. Так, в концентрации 50 мкг/мл препарат способствовал уменьшению количества жизнеспособных вирионов ВПГ1 более чем в 10 000 раз, но инактивировал все вирионы ВПГ2.

Изучение профилактического эффекта применения Мирамистина® на модели инфекции, вызванной ВПГ2 и ВПГ1 в культуре клеток VeroB, позволило установить следующее.

Таблица 2

Оценка профилактического действия Мирамистина® на вирионы

ВПГ1 и ВПГ2 in vitro при заражении культуры ткани VeroB

Доза мирамистина,

Титры герпесвируса (lg ТЦД50/мл) после профилактического применения Мирамистина® по разным схемам

 

Схема 3

Схема 4

Схема 5

мкг/мл

ВПГ2

ВПГ1

ВПГ2

ВПГ1

ВПГ2

ВПГ1

100-500

0*

0

0

0

0

0

50

0

5,00**

0

0

0

4,00

25

3,25

5,25

0

5,25

4,00

5,25

12

3,25

5,25

4,00

5,25

4,00

5,25

6

5,00

5,25

5,00

5,25

4,75**

5,25

0 (контроль)

5,00

5,25

5,00

5,25

5,00

5,25

Примечание: * менее 0,25 lg ТЦД50/мл; ** различия с контролем статистически недостоверны (p>0,05)

Мирамистин® в концентрациях 100-500 мкг/мл проявлял высокую профилактическую активность, которая не зависела от типа вируса простого герпеса или схемы применения препарата. При концентрациях 12-50 мкг/мл противовирусный эффект зависел от дозы препарата и в целом был более выражен в отношении ВПГ2. Так, по схеме 4 (экстреннопрофилактической) полная инактивация ВПГ2 отмечалась при концентрации Мирамистина® 25 мкг/мл (по схемам 3 и 5 - при концентрации 50 мкг/мл). Полная инактивация ВПГ1 по схеме 4 отмечена при концентрации 50 мкг/мл, по двум другим схемам - 100 мкг/мл или выше. В присутствии 12-25 мкг/мл Мирамистина®, применяемого по схемам 3 или 5, инфекционность ВПГ2 снижалась в 10-56 раз (что соответствует снижению титра виру са на 1,00-1,75 lg). Вместе с тем эффективность Мирамистина® при внесении в культуру ткани была существенно ниже, чем та, которая выявлена при оценке прямого вирулицидного действия препарата на ВПГ1, но не на ВПГ2. Повидимому, это связано с различиями в динамике взаимодействия использованных штаммов вирусов с клетками данной линии. Так, при концентрации 50 мкг/мл Мирамистина®, применяемого по схеме 3, титр ВПГ1 составил 5 lg ТЦД50/мл (при оценке вирулицидного действия - 1 lg ТЦД50/мл). Из полученных данных следует, что по противогерпетической эффективности в отношении ВПГ2 ис пользованные схемы применения Мирамистина® можно расположить так: схема 4 > схема 3 > схема 5, а в отношении ВПГ1 - схема 4 > схема 5 > схема 3.

Препарат сравнения (зовиракс) в широком диапазоне концентраций обеспечивал полное блокирование ЦПД вируса в течение 96часового периода наблюдения не только при низкой, но и при высокой множественности инфицирования. Следует отметить, что при внесении на ранних этапах после заражения (через 1 час после адсорбции вируса) этот препарат с высокой степенью достоверности снижал инфекционность испытанных вирусов (табл. 3). Эффективность его действия по мере снижения концентрации плавно снижалась. МИД50 препарата по отношению к ВПГ2 составляет 0,2 мкг/мл, по отношению к ВПГ1 - 0,7 мкг/мл.

Из представленных данных следует, что в экспериментах in vitro на модели герпесвирусной инфекции в культуре чувствительных клеток VeroB, обусловленной ВПГ1 (штамм «ЕС») и ВПГ2 (штамм «ВН»), Мирамистин® обладает выраженным

Таблица 3

Эффективность препарата зовиракс в отношении вируса
ВПГ1 и ВПГ2 при использовании по схеме 5
(через 1 час после инфицирования клеток VeroB).

Доза зовиракса, мкг/мл

Вирус простого герпеса 2го типа, шт. ВН

Вирус простого герпеса 1го типа, шт. ЕС

Титр вируса, lg ТЦД50/мл

Снижение титра относительно контроля, lg ТЦД50/мл

Титр вируса, lg ТЦД50/мл

Снижение титра относительно контроля, lg ТЦД50/мл

62,5

1,50

3,50

1,50

4,00

31,5

1,50

3,50

1,50

4,00

15,0

2,00

3,00

2,00

3,50

7,5

2,00

3,00

2,00

3,50

3,5

2,00

3,00

2,50

3,00

1,5

2,50

2,50

2,50

3,00

0,75

3,00

2,00

3,00

2,50

0,35

3,50

1,50

3,50

2,00

0,15

3,75

1,25

4,50

1,00

0,07

4,25

0,75

Н.и.

-

0 (контроль)

5,00

-

5,50

-

      

 Примечание: Н.И. - не исследовали.

противовирусньм эффектом. Противогерпетическая активность в отношении ВПГ находится в прямой зависимости от концентрации препарата. Оптимальными для предотвращения репродукции этих вирусов в клетках VeroB следует считать концентрации Мирамистина® 50-500 мкг/мл (от 0,05% до 0,005%). Полученные результаты согласуются с ранее выявленной противовирусной активностью мирамистина в отношении других сложноустроенных вирусов [1] и подтверждают роль суперкапсида как главной мишени противовирусной активности этого препарата.

В наших исследованиях выявлена вирулицидная активность препарата в отношении как ВПГ1, так и ВПГ2.

При использовании разных профилактических схем обработки препарат обладал выраженной противовирусной активностью в отношении ВПГ2 и менее выраженной активностью - в отношении ВПГ1. Для выяснения отличий в действии Мирамистина® на ВПГ1, шт. ЕС, требуется проведение дополнительных исследований с использованием других штаммов ВПГ1.

В целом полученные результаты свидетельствуют о возможности использования Мирамистина® в комплексной терапии ГИ.

Выводы

  • Мирамистин® обладает выраженной противовирусной активностью в отношении вируса простого герпеса, проявляет вирулицидные свойства и обладает способностью тормозить репликацию вирусов в инфицированных культурах клеток, что приводит к существенному снижению титров инфекционной активности ВПГ.
  • При использовании разных профилактических схем обработки препарат проявляет выраженную противовирусную активность в отношении ВПГ2 и менее выраженную - в отношении ВПГ1.
  • Противогерпетическая активность Мирамистина® в отношении ВПГ находится в прямой зависимости от концентрации препарата.

Литература

 Изучение in vitro антивирусных свойств Мирамистина® в отношении вирусов кори и паротита // А. П. Агафонов, М. О. Скарнович, В. А. Петрищенко и соавт. Антибиотики и химиотерапия, 2005. - Вып. 50. - №№ 5-6. - С. 17-19.

Криворутченко Ю. Л. Дозозависимая инактивация мирамистином внеклеточного вируса иммунодефицита человека. // Вопр. вирусол. - 1998. - № 3. - С. 122-124.

Ларкин Г. Ф. В кн.: Биометрия. - М., 1980. - С. 106-107.

Пшеничников В. А., Семенов Б. Ф., Зезеров Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. - М., 1974. - С. 123-126.

Bacon Т. Н., Levin M. J., Leary J. J., Sarisky R. T. and Sutton D. Herpes simplex virus resistance to acyclovir and penciclovir after two decades of antiviral therapy. Clinical Microbiology Reviews, 2003. - V.16. - № l. - P. 114-128.

Cotarelo M., Catalan P., SanchezCarrillo C., Menasalvas A., Cercenado

E. et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in vitro sus ceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. J. Antimicrob. Chemother., 1999. - V. 44. - P. 705-708.

De Clerg E., Descamhs J., Verkelst G. et al.        J. Inf. Dis., 1980. - V.141. - N 5. - P. 563-574.

Kruppenbacher J. P., Klass R. and Eggers H. J. A rapid and reliable assay for testing acyclovir sensitivity of clinical herpes simplex virus isolates independent of virus dose and reading time. Antiviral Res., 1994. - V. 23. - P. 11-22.