Микобактериальная активность Мирамистина® "in vitro"

Активность антисептического средства Мирамистин® в отношении микробактерий
в эксперименте in vitro 

Научно-исследовательский институт скорой помощи
им. Н. В. Склифосовского
ГОРОДСКОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ СЕМИНАР
"Использование препарата мирамистин в лечебно-профилактических учреждениях г. Москвы"

Иртуганова О. А., Смирнова Н. С., Кривошеин Ю. С.,
Свистов В. В., Смирнов И. В., Гришин М.Н.
Центральный НИИ туберкулеза РАМН, Компания «Инфамед»

В последние годы  терапия  противотуберкулёзными препаратами  (ПТП)      больных туберкулезом значительно усложнилась. Главной причиной возникшей ситуации является эволюция  микобактерии туберкулеза (МБТ) в штаммы, резистентные к ПТП.

Одним   из   путей   преодоления   лекарственной резистентности МБТ        является  применение  ПТП в сочетании с другими биологически активными веществами. Доказано, что в присутствии ПАВ возрастает активность многих антибиотиков в отношении устойчивых к ним патогенных штаммов микроорганизмов.     Механизм этого влияния  связывают в основном   с увеличением проницаемости клеточной стенки микроорганизма под действием ПАВ, с подавлением   активности ферментов микробной клетки разрушающих антибиотики и эллиминацией R-плазмид. Сведений о влиянии ПАВ на МБТ, обладающих полирезистентностью к ПТП, нам в научной литературе обнаружить не удалось.

Цель исследования: оценить антимикобактериальную активность отечественного антимикробного препарата Мирамистина® (М),  который уже нашел  применение при лечении острой и хронической неспецифической бронхо-легочной патологии, в отношении патогенных штаммов микобактерий in vitro.

Материалы и методы   

Исследование активности М проводили с использованием двух- и трехнедельных культур следующих штаммов микобактерий, хранящихся в музее культур Центральный НИИ туберкулеза РАМН:

M. tuberculosis H37Rv, вирулентный лабораторный штамм, чувствительный к противотуберкулезным препаратам (ПТП);

M. tuberculosis - чувствительный ко всем ПТП, выделен от больного;

M. tuberculosis - выделен от больного, устойчивый к изониазиду;

M. tuberculosis - выделен от больного, устойчив к изониазиду и рифампицину;

M. bovis - возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота;

M. kansasii - потенциально-патогенный, фотохромогенный штамм микобактерий;

M. avium - потенциально-патогенный штамм;

M. fortuitum - быстрорастущий сапрофитный штамм.

В задачи исследования входило определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) и бактерицидной активности М для клинически значимых штаммов микобактерий, определение периода задержки роста культур после контакта с бактериостатическими концентрациями М, а также изучение туберкулостатической активности М в присутствии основных противотуберкулезных препаратов - изониазид, фтивазид, ПАСК, рифампицин,     этионамид, этамбутол, стрептомицин, канамицин.

МПК определяли стандартным методом серийных разведений М на жидкой среде Middlebrook 7H9 с добавлением OADC. Для этого 10⁷ клеток микобактерий в изотоническом растворе хлорида натрия вносили в  пробирки из расчета 0,2 мл взвеси на 2 мл среды без М и с убывающими концентрациями препарата (800...6,25 мкг/мл). Через 10 дней инкубации при 37ºС содержимое пробирок центрифугировали, из осадков делали мазки, окрашенные по Цилю-Нильсену, и по 0,2 мл из каждой пробирки засевали на скошенную среду Левенштейна-Йенсена. Результаты оценивали по количеству микобактерий в поле зрения микроскопа и по интенсивности образования микроколоний. За МПК принимали минимальную концентрацию М, при которой наблюдалось частичное или полное подавление роста микобактерий (1-9 клеток на 100 полей зрения). Бактерицидные концентрации М определяли по отсутствию роста в высевах на среде Левенштейна-Йенсена, которую инкубировали при 37°С с еженедельным учетом результатов (для медленнорастущих - через 3-4 недели).

Для определения эффекта совместного действия М и основных противотуберкулезных препаратов к двукратным разведениям М (50...6,25 мкг/мл) добавляли ПТП в суббактериостатических концентрациях. В этих опытах использованы два полирезистентных и один изониазидорезистентный штамм M. tuberculosis.

Постлекарственный эффект оценивали по срокам визуализации роста культур 3 штаммов микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена после 20-часового  контакта их с М в концентрации 0, 100 и 500 мкг/мл в среде Middlebrook 7H9 при 37⁰С.

Результаты исследования

Установлено, что М в концентрации 50-100 мкг/мл обладает бактериостатическим действием на патогенные и условнопатогенные микобактерии (табл.1). В концентрации 100 мкг/мл М полностью подавлял рост штамма Н37Rv, в концентрации 50 мкг/мл  -  частично. МБК М в отношении патогенных M. tuberculosis как чувствительных, так и устойчивых к ПТП, составила 100 мкг/мл. Для потенциально патогенных микобактерий МБК была в 2 раза выше (200 мкг/мл), причем наиболее высокое значение МПК (400 мкг/мл) - у быстрорастущего штамма M. fortuitum.

Результаты экспериментов по оценке постлекарственного эффекта М для 3-х штаммов микобактерий представлены в табл. 2. Степень задержки роста на плотной среде, выраженная в днях, характеризовала влияние М на жизнеспособность популяции. Удлинение лаг-фазы (периода до появления видимого роста) свидетельствовало о повреждающем действии М на клетки микобактерий.

Таблица 1

Результаты определения минимальных подавляющих концентраций М  для культур клинически значимых микобактерий

Таблица 2

Длительность лаг-фазы у культур патогенных микобактерий после их контакта с М  в течение 20 ч

При густоте суспензии 10⁶  кл/мл М в концентрации 100 мкг/мл не влиял на сроки визуализации роста изученных штаммов. Заметный эффект наблюдался при воздействии 500 мкг/мл на микробную взвесь, содержащую 10⁵ кл/мл.

При этом в контроле рост M. tuberculosis Н37Rv и M. kansasii появлялся на 12-й, а после инкубации с М - на 24-й день. Рост штамма M. tuberculosis, устойчивого к ПТП, также появлялся с задержкой (на 11 дней, по сравнению с контролем)   на контроле появлялся на 18 день, а после инкубации с М  (500 мкг/мл) - на 29 день, т.е. на 11 дней позже. Таким образом, при определенных условиях наблюдался эффект последействия М. Вместе с тем 20-часовая экспозиция не оказывает существенного туберкулостатического воздействия.

В серии экспериментов по изучению туберкулостатической активности М в присутствии суббактериостатических концентраций  ПТП в отношении резистентных к ним штаммов M. tuberculosis,   получены следующие результаты. Синергидный эффект отмечен при комбинации М с этамбутолом и этионамидом, аддитивный - в сочетании со стрептомицином и ПАСК. При сочетании  М  с рифампицином, изониазидом и канамицином отмечен индифферентный эффект - наблюдался обычный рост указанных тест-штаммов в  присутствии суббактериостатических концентраций этих препаратов. 

Независимо от присутствия указанных ПТП рост штаммов частично подавлялся при концентрации М 50 мкг/мл, которая соответствовала МПК этого препарата.

Заключение

В опытах in vitro установлено, что Мирамистин® обладает антимикобактериальной активностью в концентрациях 50-100 мкг/мл и выше. Полученные данные позволяют рекомендовать проведение испытаний этого препарата в условиях клиники с целью подтверждения его терапевтической эффективности при различных формах инфекции,  вызванной микобактериями.